问:LUC标记细胞小动物成瘤后检测底物需要注射到肿瘤部位吗?
答:在活体生物发光成像(BLI)中,D-荧光素(luciferin)经腹腔(IP)或皮下(SC)注射后即可通过血液循环到达全身各处,与已表达荧光素酶的肿瘤细胞反应,因此无需直接注射到肿瘤局部即可实现成像。
问:小动物成瘤后检测不到 LUC 荧光怎么办?
答:常见原因可按“表达-递送-反应-采集”四步排查,具体如下, 收藏起来,LUC标记的小动物实验轻松过关!
(一)表达环节
1. 荧光素酶(Luc)表达丢失:体外筛到的“阳性”克隆在体内传代或冻存后发生启动子甲基化、质粒丢失,导致实际表达量低于仪器检测限。
2. 免疫清除:在免疫健全小鼠中,Luc 作为外源蛋白可被CD8⁺ T细胞识别并杀伤高表达细胞,造成信号进行性下降甚至消失。
3. 启动子沉默:CMV 等病毒启动子易受 IFN-γ 等细胞因子影响而下调,尤其在炎症或坏死区域。
(二)底物递送环节驾驶安全
1. 底物量不足:腹腔注射剂量一般按150mg/kg计算,若称重或稀释有误,或动物麻醉过深导致循环衰竭,底物难以到达肿瘤。
2. 给药途径不当:皮下/尾静脉注射时漏液,或肿瘤血供差(中心大面积坏死),局部底物浓度低于Km值。
3. 底物失效:D-荧光素反复冻融、室温放置 >2h会降解;粉末受潮也会失活。
(三)反应环境环节
1. 缺氧:肿瘤>8 mm时中心常严重缺血缺氧,荧光素酶反应需O₂和ATP,缺氧区信号会显著减弱。
2. pH 过低:坏死核心区pH<6.5会抑制酶活。
3. 底物竞争/抑制:血中高浓度脂肪酸、抗生素(如四环素)或动物同时给予其他荧光试剂,可产生抑制或吸收。
(四)信号采集环节
1. 仪器参数设置:曝光时间过短(<1 s)、binning值过低、光圈未全开都会漏掉弱信号;背景扣除阈值设得过高也会把真实信号“归零”。
2. 毛发/位置干扰:黑毛或金属耳标对560nm光子吸收强;深部脏器(胰腺、颅内)未用37 °C预热台,也造成信号衰减。
3. 采集窗口错过:峰值一般在底物注射后10–15 min(小鼠),若延迟到 30min以后,信号已下降80%以上。
LUC检测不到怎么办?
① 体外再测一次细胞Luc活性(加底物立即发光可排除表达问题);
② 同批底物在已知阳性瘤小鼠上测试,可排除底物/仪器因素;
③ 取瘤体做IHC或Western确认Luc蛋白是否仍在;
④ 若怀疑免疫清除,可改用Nude/NSG小鼠或短暂免疫抑制(环孢素3d)再挑战。
LUC检测不到怎么办?
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